Phát hiện lao bằng phương pháp PCR
3/15/2019 10:38:43 AM
0
Ths. Phạm Quỳnh Liên, PGS. TS. Lê Văn Phủng

1. Ý nghĩa xét nghiệm

Lao là một nhiễm trùng do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis thường gặp nhất ở phổi nhưng cũng có thể gặp ở bất cứ cơ quan nào như lao màng não, lao hạch, hệ niệu dục, xương và khớp.

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới WHO 2018, lao là một trong 10 nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới và là nguyên nhân gây ra nhiều ca tử vong hơn HIV. Vi khuẩn lao có thể tồn tại trong không khí đến khoảng 6 tiếng, do đó cứ 1 người bị lao phổi mà chưa được điều trị khi ho khạc sẽ giải phóng ra vi khuẩn có thể lây cho 10-15 người khác, nhất là trong các quần thể dân cư nhỏ như gia đình, lớp học, trại tập trung. Tuy nhiên, nếu đã được điều trị bằng thuốc chống lao, khả năng lây bệnh sẽ thấp hơn. Do đó, việc phát hiện và điều trị kịp thời đối với bệnh lao rất quan trọng.

Hình 1: Sự lây lan của vi khuẩn lao

Hiện nay, vi khuẩn lao được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như: xét nghiệm đờm (nhuộm Ziehl-Neelsen), nuôi cấy, X-quang, phản ứng Mantoux hay soi phế quản... Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại một số mặt hạn chế: hoặc tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, hoặc cho kết quả có độ chính xác không cao, không phát hiện được vi khuẩn lao ở nồng độ thấp...

Phương pháp nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán lao, tuy nhiên Mycobacterium tuberculosis phân chia mỗi 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời gian phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác vì vậy kết quả chẩn đoán thường chỉ trả sau 2-8 tuần.

Việc tìm kiếm một phương pháp khác vừa giúp cho quá trình chẩn đoán vi khuẩn lao nhanh chóng hơn (trong vài giờ), vừa hiệu quả hơn đã được đề ra. Kỹ thuật khuếch đại chuỗi acid nucleic, tên tiếng anh là Polymerase Chain Reaction (PCR) là một trong những bước tiến vĩ đại của sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán y sinh học có thể giải quyết được cả hai vấn đề nêu trên.

2. Nguyên lí xét nghiệm

Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh (vi khuẩn lao) trực tiếp trong bệnh phẩm chỉ sau vài giờ nhờ khả năng nhận biết, sao chép và khuyếch đại để tạo ra hàng triệu bản sao từ 1 đoạn trình tự đặc hiệu trên genom của vi khuẩn. Trình tự phổ biến đang được sử dụng là 249 cặp bazơ nằm trên đoạn gen IS6110 của vi khuẩn lao, đoạn gen này có tính bảo tồn cao đồng thời có tỷ lệ lặp lại từ 20-25 lần nhờ đó làm tăng khả năng phát hiện của phản ứng. Ngoài ra, người ta còn sử dụng các trình tự đích khác để chẩn đoán như IS1081, 23S rDNA, 16S rDNA.

Ngoài thời gian xét nghiệm ngắn (vài giờ) một ưu điểm nổi bật nữa của kỹ thuật PCR là có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có khả năng phát hiện được đoạn gen đích ngay cả với số lượng ít (vài copy). Theo Montenegro SH và cộng sự khi tiến hành khảo sát trên 222 bệnh nhi đã cho thấy rằng sử dụng phương pháp PCR cho kết quả có độ đặc nhạy là 90.4% và độ đặc hiệu là 94% khi so sánh với phương pháp nuôi cấy (tiêu chuẩn vàng) (5). Ngoài ra, trong một bài viết của Emmanuel O. Babafemi và cộng sự đã khảo sát rất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy rằng, độ nhạy của phương pháp PCR nói chung là trên 90% cao hơn rất nhiều so với phương pháp nhuộm soi (<40%) (6).

Tại Việt Nam, theo bài giảng của Học viện Quân y 103 đã thống kê các giới hạn phát hiện của các phương pháp chẩn đoán lao phổi như sau:

Tên phương pháp

Giới hạn phát hiện (vi khuẩn/ml)

Nuôi cấy MGIT

10-100

Kháng nguyên

50-10.000

Soi phát quang

10.000

PCR

1-3

Kỹ thuật PCR có thể phát hiện được vi khuẩn lao ngay cả ở nồng độ rất thấp khoảng 1-3 vi khuẩn/mL bệnh phẩm (trong khi soi kính chỉ phát hiện được khi có khoảng 105 vi khuẩn/mL bệnh phẩm). Điều đó cho thấy sự hữu dụng của phương pháp PCR trong việc xét nghiệm tìm vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm nói chung và các mẫu bệnh phẩm đặc biệt như dịch não tủy, dịch ổ khớp, dịch màng tim… nơi mà lượng vi khuẩn trong đó thường không nhiều.

Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC hiện nay đang sử dụng phương pháp realtime PCR (là một cải tiến kỹ thuật cao hơn của phương pháp PCR) để phát hiện Lao. Với công nghệ đầu dò Taqman (Taqman probe) cùng chứng nội tại (Internal control) được cho vào ngay từ quá trình tách chiết cho phép kiểm soát toàn bộ quá trình xét nghiệm từ đó cho ra kết quả nhanh chóng và chính xác hơn.

Sau phản ứng, nếu kết quả trả ra là dương tính, điều đó có nghĩa trong mẫu bệnh phẩm có sự tồn tại của genome vi khuẩn lao (nhưng không khằng định được vi khuẩn còn sống hay đã chết), còn nếu kết quả trả ra là âm tính, có nghĩa không phát hiện genome vi khuẩn. Giống như tất cả các xét nghiệm khác, kỹ thuật PCR cũng chỉ có giá trị chẩn đoán và kết luận trên mẫu bệnh phẩm.

3. Chỉ định:

- Bất cứ ai có triệu chứng hay dấu chứng nghi lao như mệt mỏi, giảm khả năng làm việc, ăn kém, gầy sút, sốt nhẹ về chiều tối (37°5 – 38°C) kèm theo ra mồ hôi về ban đêm, da xanh…, hoặc phơi nhiễm với lao đặc biệt có hiện tượng ho kéo dài trên 2 tuần, đau ngực, khó thở.

- Các trường hợp nghi nhiễm lao mà không phát hiện được bằng các phương pháp khác, các bệnh phẩm là dịch cơ thể đặc biệt như dịch não tủy, hoặc các dịch khớp, dịch ổ bụng, dịch màng tim…

-Các trường hợp mắc bệnh suy giảm miễn dịch như đái tháo đường, dùng Corticoid kéo dài, nhiễm HIV/AIDS, tiền sử chấn thương ngực, nghiện rượu, tiêm chích ma tuý, mổ cắt đoạn dạ dầy, viêm đại tràng mạn...

- Các trường hợp cần phải chẩn đoán phân biệt với các bệnh như: Viêm phổi (do các vi trùng tạo hang Staphylococcus, Klebsiella…), virus, bệnh ký sinh trùng, nang hyatid. Bệnh lý ác tính (carcinome phế quản, lymphoma, leukaemia…). Bụi phổi. Viêm mạch (bệnh lý u hạt Wegener, bệnh lý Rheumatoid nodule, viêm phổi tắc nghẽn). Xơ hóa phổi. Nhồi máu phổi. Viêm phế nang dị ứng ngoại sinh, Sarcoidosis.

4. Một số yếu tố ảnh hưởng và hạn chế của xét nghiệm.

Mặc dù xét nghiệm PCR rất hữu ích trong quá trình phát hiện vi khuẩn lao nhưng vẫn còn tồn tại một số hạn chế nhất định, những hạn chế này cần được tư vấn để mọi người có thể hiểu rõ và tuân thủ.

- PCR là kỹ thuật phức tạp đòi hỏi trang bị tốn kém, giá thành đắt, đồng thời với độ nhạy phản ứng rất cao đòi hỏi nhân viên kỹ thuật phải giàu kinh nghiệm, có trình độ cao, tuân thủ chặt chẽ qui trình kỹ thuật để tránh hiện tượng dương tính giả khi bị nhiễm lại sản phẩm PCR nên không phải ở bất cứ bệnh viện nào cũng có thể tiến hành được.

- Việc sử dụng thuốc kháng sinh hoặc bảo quản bệnh phẩm không đúng cách có thể gây ức chế phản ứng PCR và không cho ra được kết quả cho bệnh nhân.

- Ngoài ra việc xuất hiện đột biến mất đoạn IS 6110 trong phân tử DNA (tỷ lệ nhỏ khoảng vài phần trăm) cũng sẽ gây hiện tượng âm tính giả.

- 2 mẫu bệnh phẩm từ cùng 1 bệnh nhân có thể cho kết quả khác nhau do cách lấy mẫu có đúng qui định hay không. Việc lấy mẫu không đúng cách cũng là một nguyên nhân quan trọng gây âm tính giả.

5. Cách lấy mẫu- vận chuyển- bảo quản mẫu

Các kết quả xét nghiệm có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán, điều trị chăm sóc bệnh nhân. Vì vậy phải đảm bảo đúng các nguyên tắc từ khi lấy bệnh phẩm, theo đúng hướng dẫn của Bộ Y tế:

Hình 2: Cách lấy mẫu đờm

- Bệnh nhân không dùng thuốc kháng sinh trong vòng ít nhất 3 ngày.

- Tiến hành lấy đờm vào buổi sáng, súc miệng với nước lọc. Bệnh nhân phải hít thở sâu 3 lần: hít hơi vào thật sâu, nín thở vài giây và thở ra chầm chậm.Hít hơi vào thật sâu, ho mạnh cho đến khi có đàm trong miệng, rồi nhẹ nhàng nhổ hết đàm vào trong lọ vô trùng.

- PCR lao có thể làm trên nhiều mẫu bệnh phẩm khác nhau ngoài đờm như dịch rửa phế quản, dịch màng phổi, dịch não tủy, dịch màng tim, dịch khớp… Các bệnh phẩm trên cần được nhân viên kỹ thuật lấy theo đúng quy trình.

- Mẫu bệnh phẩm sau khi được lấycó thể bảo quản ở nhiệt độ thường trong vòng 24h, ở nhiệt độ từ 2-80C dưới 48h hoặc -200C dưới 1 tuần.

Số bệnh nhân mắc lao ngày càng gia tăng nhanh chóng, thêm vào đó là sự xuất hiện của các chủng Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc, phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh lao phổi có một ý nghĩa quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng. Việc chẩn đoán sớm vi khuẩn lao sẽ giúp đưa ra hướng điều trị thích hợp nhằm tránh tình trạng uống thuốc không đúng bệnh, như vậy rất dễ tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc.

Tuy vẫn còn những hạn chế như song kỹ thuật PCR cùng những tiến bộ trong ngành sinh học phân tử y học đang mở ra những hy vọng tương lai không xa người ta có thể ngăn chặn được sự lây lan của vi khuẩn lao trên người.

Tài liệu tham khảo:

1. Bài giảng chuyên ngành “Lao và bệnh phổi”, Học viện quân y, 2015

2. World Health Organization, Global tuberculosis control, WHO library, 2018.

3. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2004), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.

4. Kabir S, Uddin MKM, Chisti MJ, Fannana T, Haque ME, Uddin MR, Banu S, Ahmed T. (2018), “Role of PCR method using IS6110 primer in detecting Mycobacterium tuberculosis among the clinically diagnosed childhood tuberculosis patients at an urban hospital in Dhaka, Bangladesh”, International Journal of Infectious Diseases, March 2018, Volume 68, p 108-114.

5. Montenegro SH, Gilman RH, Sheen P, Cama R, Caviedes L, Hopper T, et al. “Improved detection of Mycobacterium tuberculosis in Peruvian children by use of a

heminested IS6110 polymerase chain reaction assay”. Clin Infect Dis 2003;36

(1):16–23.

6. Emmanuel O. Babafemi, Benny P. Cherian,  Lee Banting, Graham A.Mills, and Kandala Ngianga. “Effectiveness of real-time polymerase chain reaction assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis in pathological samples: a systematic review and meta-analysis”  BioMed Central 2017, doi: 10.1186/s13643-017-0608-2.

7. “ Hướng dẫn lẫy mẫu, đóng gói, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm truyền nhiễm” Bộ y tế, cục y tế dự phòng.

 

Mọi chi tiết, khách hàng vui lòng liên hệ:

Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC

Địa chỉ: 42 Nghĩa Dũng, Ba Đình | 99 Trích Sài, Tây Hồ, Hà Nội

Tổng đài: 1900 56 56 56

Website: www.medlatec.vn