1. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polymerase), xét nghiệm PCR

1.1. Quá trình phát hiện kỹ thuật PCR thông qua xét nghiệm PCR

Vào một buổi tối cuối tuần của tháng 4 năm 1983, trong lúc đang lái xe trên đường ở gần vùng đồi núi của California, một ý tưởng loé lên trong đầu của Kary Mullis khi ông phải lùi xe lại do chạy lố đường, hình ảnh hai làn bánh xe mới tách khỏi hai làn bánh xe cũ: "Dùng nhiệt độ tách sợi đôi ADN thành hai mạch đơn ". Lúc đó Kary Mullis chỉ là một nhà hoá sinh học bình thường, đang làm việc trong một phòng thí nghiệm nhỏ.

Từ ý tưởng đó, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) vào năm 1985, tạo nên một cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa học. Chỉ sau 8 năm (1993), K. Mullis đã được trao giải Nobel về hoá học nhờ phát minh này.

1.2. Nguyên lý của kỹ thuật PCR thông qua xét nghiệm PCR

Từ một đoạn ADN chọn lọc , nó sẽ được nhân lên gấp hàng triệu lần hoặc hơn nữa trong một thời gian ngắn. Trong thời gian này, sự sao chép ADN được tạo ra trong môi trường in vitro như trong quá trình phân bào.

Để tạo được quá trình này, trước tiên chuỗi ADN kép được làm nóng đến mức bị tách thành hai nhánh đơn. Làm nguội các nhánh đơn này rồi nhờ xúc tác của enzym ADN polymerase và các tiền chất deoxynucleotid tương ứng để nhánh ADN bổ sung được tổng hợp. Trong ống nghiệm, quá trình này không thể tự xảy ra được mà phải có các đoạn ADN mồi (primers) sẽ tổng hợp với những vị trí bổ sung trên hai chuỗi đơn. Các đoạn mồi khởi động đặc thù thường được tổng hợp nhân tạo. Từ vị trí gắn của mồi khởi động, nhánh bổ sung sẽ được tổng hợp. Mồi khởi động mang tính đặc thù riêng cho mỗi ADN có trình tự nhất định. Với mỗi loại mồi khởi động thì chỉ ADN đặc hiệu với nó được sao chép.

Sau khi các chuỗi bổ sung đã được tổng hợp xong, hai chuỗi kép được tạo thành qua quá trình này sẽ lại được dùng nhiệt để tách ra và quá trình tổng hợp lại được lặp lại như trên để sản sinh ra 4 chuỗi ADN và cứ như thế tiếp diễn.

Bằng cách sử dụng một loại ADN polymerase bền với nhiệt (Taq polymerase), có thể trộn lẫn bệnh phẩm với các tiền chất deoxynucleotid, mồi thử cho hai chuỗi và polymerase, sau đó hỗn hợp này được đưa vào chu trình xử lý bằng nhiệt độ thích hợp với sự tách chuỗi, tiếp cận của mồi và tổng hợp các chuỗi bổ sung. Trong vòng 60 phút, sự khuếch đại có thể lên đến 1 triệu lần. ADN khuếch đại sẽ dễ dàng được phát hiện bằng các phương pháp khác nhau, thông thường nhất, bằng điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide.

ADN polymerase chịu nhiệt đầu tiên được sử dụng có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus (Taq polymerase). Hiện nay, hầu hết Taq polymerase đều được trích từ E.coli tái tổ hợp.

2. Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong y học thông qua xét nghiệm PCR

Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn ADN rất nhỏ như: một giọt máu, một sợi tóc hay một tế bào… người ta có thể khuếch đại chính xác, trật tự một lượng lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng thông qua xét nghiệm PCR. Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN…

PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học: trong chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA 1 - BRCA 2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh…), nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…

Trong Vi sinh học, PCR là một phương tiện hữu dụng để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh trong các trường hợp:

• Tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1…), các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).
• Tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết quả chậm: M. tuberculosis.
• Tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó (vd: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu…).

PCR cũng được dùng để xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli, và gần đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố ruột (enterofoxigenic Escherichia Coli, ETEC); vt1 và vt2 của E. coli gây chảy máu đường ruột (enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC); eaeA và bfpA của E. coli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial của E.coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) và Shigella đã được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại Escherichia coli gây tiêu chảy.

PCR khuyếch đại các gen nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn.

Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT - cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng. PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, có thể phân biệt một cách chắc chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG). Clostridium difficile cũng được định loại thông qua xác định các loại độc tố riêng biệt của chúng bằng PCR.

PCR còn được dùng để nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn. Từ trước đến nay, tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh được xác định bằng các kỹ thuật dựa trên nuôi cấy như kháng sinh đồ theo Kirby Bauer (khuếch tán trên thạch) và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimal Inhibitory Concentration). Các kỹ thuật này chiếm nhiều thời gian nên khó cho phép có định hướng điều trị kịp thời trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp. Ngoài ra, các kỹ thuật nuôi cấy có hiệu quả phục vụ điều trị không cao đối với một số vi sinh vật, như Mycobacterium tuberculosis, có thời gian tăng trưởng rất dài (nhiều tuần lễ). Với kỹ thuật PCR, người ta có thể phát hiện nhanh tính kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh qua khảo sát gen kháng thuốc. Ví dụ, khảo sát gen pbp1a và 2a của Streptococcus pneumoniae bằng kỹ thuật PCR-SSCP, kỹ thuật PCR phát hiện đột biến kháng Rifamicin ở gen rpoB , phát hiện kháng INH do thiếu gen catalase (gen Kat G) của vi khuẩn Lao...

Trong lĩnh vực ký sinh trùng, người ta dùng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lỵ amíp, Leishmania, Echinococcus, Microsporidia, Giardia, Cryptosporidium, Toxoplasma gondii…

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hoàng Minh (2001), «Một số kỹ thuật sinh học phân tử hoá sinh và vi sinh trong chẩn đoán bệnh lao». Tạp chí Thông tin y dược, số 12, tháng 12 năm 2001.

2. Lê Văn Phủng (2001), «Một số ứng dụng của PCR trong vi sinh vật». Tạp chí Y học thực hành 2001.

3. Hoàng Văn Sơn (2002), «Thành tựu mới của sinh học phân tử trong ung thư học». Tạp chí Thông tin y dược, số 2, tháng 2 năm 2002, tr. 8 -10.

4. Phạm Hùng Vân (1996). «Phản ứng chuỗi polymerase (PCR), một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử». Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh. Số đặc biệt năm 1996, tr. 27 - 35.

5. Banavaliker J.N., Bobby Bhalotra, Sharma D.C., Manoj K. Goel (1998), «Identification of Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction in clinical specimens». Ind J Tub, 45. 15.

6. Richard Frothingham (1996), « Applications of the polymerase chain reaction to infectious disease diagnosis ». Ann Saudi Med1996; 16: 657 - 665. Review Article.

7. Wayne W. Grody (2006), «Molecular Diagnostics Overview and Focus on Infectious Diseases: An Expert Interview». PRIVATEMedscape PathologyPRIVATE "TYPE=PICT;ALT=" Expert Interview.