TÓM TẮT

Hiện có hơn hai tỷ người bị nhiễm virus viêm gan B (HBV) trên toàn thế giới và hơn 350 triệu người bị nhiễm HBV mạn. Viêm gan B mạn có thể dẫn đến biến chứng nguy hiểm như xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). HBV là một hepadnaviridae với một bộ gen có sợi đôi DNA không hoàn toàn có kích thước phân tử 3,2 kb. Bộ gene của HBV có bốn khung đọc mở chồng lên nhau, mã hoá cho các protein bề mặt, lõi, X và polymerase.

Các ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán và quản lý bệnh nhân viêm gan virus B mạn gồm: số lượng virus HBV DNA trong huyết tương, kiểu gen, các đột biến ở vùng ENH II / BCP / PC và vùng PreS và các đột biến kháng thuốc ở gene polymerase (gene P). Số lượng HBV cao (>10⁴ copies/ mL) có sự liên quan một cách độc lập với sự xuất hiện và sự tái phát sau điều trị của HCC. HBV genotype (C > B) có liên quan với nguy cơ tăng lên của xơ gan và HCC. Các kiểu gen khác nhau có các kiểu đột biến riêng biệt. Các đột biến ở vùng ENH II/ BCP/PC và vùng PreS có liên quan đáng kể với tăng nguy cơ xơ gan và ung thư gan. Số lượng HBV DNA, kiểu gen và đột biến ở vùng ENH II/ BCP/ PC và vùng PreS có thể được sử dụng để dự đoán HCC. Việc phát hiện sớm các đột biến kháng thuốc trên gene P là rất quan trọng để giải thích sự thất bại của điều trị và hướng dẫn các quyết định điều trị tiếp theo.

Một số marker phân tử có tiềm năng chẩn đoán và quản lý bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn trong tương lai bao gồm: số lượng HBV DNA và cccDNA toàn phần trong gan hoặc mức độ cccDNA trong huyết tương. 

ABSTRACT 

Applications of molecular biology in the diagnosis and management of patients with chronic heratits B virus infection

                                                                                                       Luat N N 

                                                                                       MEDLATEC General Hospital

More than two billion people have been infected with Hepatitis B virus (HBV) worldwide, and more than 350 million suffer from chronic HBV infection. Chronic hepatitis B can lead to serious complications such as cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). HBV is the hepadnaviridae with an incomplete double-stranded DNA genome of 3.2 kb. HBV genome contains four overlapping open reading frames that encode the surface, core, X, and polymerase proteins.

Applications of molecular biology in the diagnosis and management of patients with chronic hepatitis B virus infection include: plasma HBV DNA viral load, genotypes, the mutants in Enh II/ BCP/ PC region and the PreS region, and drug-resistance mutations in P gene. High HBV load (>10⁴ copies/mL) is independently associated with the occurrence and post-treatment recurrence of HCC. HBV genotype (C>B) is associated with increased risks of cirrhosis and HCC. Different genotypes have distint patterns of mutations.  The mutants in Enh II/ BCP/ PC region and the PreS region are significantly associated with the increased risks of cirrhosis and HCC. HBV DNA load, HBV genotypes, and the mutations in Enh II/ BCP/ PC region and the PreS region can be used for the prediction of HCC. Early detection of drug-resistance mutations in gene P is very important for explaining treatment failures and guiding subsequent treatment decisions.

Some molecular markers have the potential diagnosis and management of patients with chronic hepatitis B virus infection in the future include: total HBV DNA and cccDNA load in liver or cccDNA level in plasma.

Hiện trên thế giới có trên 2 tỷ người bị nhiễm virus viêm gan B (HBV), trong đó có trên 350 triệu người bị viêm gan B mạn (chronic hepatitis B: CHB). Viêm gan B mạn có thể dẫn tới khoảng 1/3 các trường hợp xơ gan (liver cirrhosis: LC) và hơn 3/4 các trường hợp ung thư biểu mô tế bào gan (hepatocellular carcinoma: HCC) trên thế giới. Ung thư gan nguyên phát là nguyên nhân thứ ba gây tử vong trên thế giới do ung thư và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) chiếm 85-90% trong số những ung thư gan này. Các yếu tố nguy cơ đối với ung thư biểu mô tế bào gan bao gồm nhiễm virus viêm gan B hoặc virus viêm gan C (HCV) mạn, tuổi già, giới nam, nhiễm aflatoxin B1, nghiện rượu, đái tháo đường, bệnh gan nhiễm mỡ không do alcol, nhiễm sắc tố sắt (hemochromatosis) và các yếu tố di truyền của vật chủ. Trong số các nguyên nhân đó, nhiễm virus viêm gan B mạn là một yếu tố gây ung thư biểu mô tế bào gan chủ yếu trên thế giới.

 
Hình 1. Cấu trúc bộ gene của HBV

Bộ gene của virus viêm gan B là một  chuỗi DNA kép không hoàn toàn có kích thước 3,2 kb (Hình 1). Bộ gen của HBV chứa 4 bộ khung mở che phủ lên nhau, mã hóa cho các protein bề mặt (surface), lõi (core), X và polymerase. Vùng basal core promoter (BCP) (từ nucleotide 1751 đến 1769) có chức năng thúc đẩy vùng precore (PC) sinh tổng hợp kháng nguyên e (HBeAg) [13]. Hiện người ta đã phát hiện tất cả 10 genotype của HBV (từ A đến J) [15]. Các genotype B và C xuất hiện chủ yếu ở Châu Á. Các nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy các đột biến trên vùng BCP/PC có liên quan một cách có ý nghĩa với nguy cơ tăng lên của xơ gan [13] và ung thư biểu mô tế bào gan [4, 7, 8, 10]. Trong số các yếu tố nguy cơ của ung thư biểu mô tế bào gan do HBV, ngoài tuổi già (>35), giới (nam>nữ), số lượng virus HBV DNA (≥10⁴ copies/mL), genotype (C>B), các đột biến vùng BCP/PC đóng vai trò rất quan trọng [4]. Các xét nghiệm sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán, theo dõi điều trị và tiên lượng viêm gan B mạn gồm: số lượng virus HBV DNA, xác định genotype, các đột biến vùng Enh II/ BCP/PC, PreS và các đột biến kháng thuốc trên gene P.

1.     Định lượng số lượng virus HBV:

 Việc định lượng số lượng virus HBV trong huyết thanh hoặc huyết tương bệnh nhân  đóng vai trò quyết định trong quá trình theo dõi diễn biến của bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị nhiễm HBV mạn. Mục đích chủ yếu của việc điều trị chống virus  HBV trong làm ức chế DNA virus huyết tương đến mức thấp nhất có thể. Nếu mức độ HBV DNA  ≤ 10⁵ copies/ mL ở bệnh nhân có HBeAg (+) tính hoặc ≤  10⁴ copies/ mL, ở bệnh nhân có HBeAg (-) tính, ALT bình thường, chưa cần điều trị, chỉ  cần theo dõi HBV DNA và ALT 6 – 12 tháng một lần.Nếu mức độ HBV DNA  là ≥ 10⁵ copies/ mL ở bệnh nhân có HBeAg (+) tính hoặc ≥ 10⁴ copies/ mL ở bệnh nhân có HBeAg (-) tính và ở bệnh nhân xơ gan còn bù, trong khi là  ≥ 10³ copies/ mL ở bệnh nhân xơ gan mất bù và có ALT tăng, cần phải điều trị.Sau khi HBV DNA giảm xuống dưới ngưỡng phát hiện, cần tiếp tục điều trị từ 6 tháng đến 1 năm để giảm nguy cơ tái phát. Ba tháng cần xét nghiệm lại HBV DNA và ALT một lần, nếu cả 3 lần HBV DNA đều (-) tính thì dừng thuốc, tiếp tục theo dõi HBV DNA 6 tháng một lần.Cần thay đổi cách  điều trị khi điều trị thất bại, là khi có sự tái phát hoặc khi đáp ứng không đủ đối với điều trị, nghĩa là HBV DNA giảm ≤  10² copies/ mL sau 3 tháng điều trị. Lúc này cần: xác định các đột biến kháng thuốc trên gen P, thay thuốc khác phù hợp hơn hoặc kết hợp thuốc, nếu cần.Theo Iloeje UH và cộng sự (2006) [5], nếu lượng virus viêm gan B (HBV DNA) luôn ở mức ≥10⁶ copies/mL thì sau khoảng 10 năm sẽ có 36,2% số bệnh nhân tiến triển thành xơ gan. Nếu số lượng virus HBV DNA giảm xuống <300 copies/mL thì chỉ còn 4,5% số bệnh nhân bị xơ gan. Sự tiến triển thành xơ gan ở các bệnh nhân viêm gan B mạn tương quan thuận mạnh với mức độ virus HBV-DNA trong máu tuần hoàn, độc lập với trạng thái HBeAg và mức độ ALT huyết thanh. Theo Chen CJ và cộng sự (2006) [1], nếu số lượng virus HBV DNA ≥ 10⁶copies/mL thì sau khoảng 10 năm sẽ có 14,9% số bệnh nhân tiến triển thành HCC. Nếu số lượng virus HBV DNA giảm xuống <300 copies/mL thì chỉ còn 1,3% số bệnh nhân tiến triển thành HCC. Mức độ HBV DNA huyết thanh tăng (≥10⁴ copies/mL) là một yếu tố dự đoán nguy cơ mạnh (strong risk predictor) của HCC, độc lập với trạng thái HBeAg, mức độ ALT huyết thanh và xơ gan [1].

2. Xác định các genotype và subtype:

Cho đến nay, 10 kiểu gene của virus viêm gan B (được sắp xếp từ A đến J) đã được phát hiện [15]. Các kiểu gen khác nhau có sự đáp ứng với điều trị ở những mức độ khác nhau.

Các kiểu gen được phân loại dựa trên sự khác nhau ít nhất 8% của bộ gen trong cấu trúc phân tử của HBV và có sự phân bố về địa lý khác nhau. Kiểu gen A gặp phổ biến ở châu Âu, châu Phi và Đông Nam Á. Kiểu gen B và C gặp chủ yếu ở châu Á, kiểu gen D gặp phổ biến ở khu vực Địa Trung Hải, Trung Đông và Ấn Độ; loại E hay gặp ở vùng cận Sahara châu Phi, kiểu gen F (hoặc H) thường chỉ gặp ở Trung và Nam Mỹ. Kiểu gen G được tìm thấy ở Pháp và Đức. Kiểu gen A, D và F chiếm ưu thế ở Brazil và tất cả các kiểu gen đều có ở Hoa Kỳ với tần số phụ thuộc vào chủng tộc.

Trong số các kiểu gen (genotypes), có 24 phân nhóm (subtypes) đã được mô tả với sự khác biệt 4-8% của bộ gen.

Kiểu gen A có hai phân nhóm: Aa (A1) ở Châu Phi/ Châu Á và Ae (A2) ở Châu Âu/ Hoa Kỳ.

Kiểu gen B có sự phân bố các phân nhóm ở 2 vùng địa lý riêng biệt: Bj/B1 ('j'-Nhật Bản ) và Ba/B2 ('a'-Châu Á ). Kiểu gen Ba được chia thành B2 - B4.
 

Kiểu gen C được chia thành 6 phân nhóm theo vùng địa lý: C1 có ở Việt Nam, Myanmar và Thái Lan; C2 có ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc, C3 có ở New Caledonia và Polynesia; C4 có ở Úc, C5 và C6 có ở Philippines.

Kiểu gen D đã được chia thành 7 phân nhóm (D1-D7).

Kiểu gen F được chia thành 4 phân nhóm (F1-F4). Phân nhóm F1 lại được chia thành 1a và 1b. Ở Venezuela có các phân nhóm F1, F2 và F3. Phân nhóm Ia, F3 và F4 được tìm thấy ở Trung Mỹ, phía Bắc và phía Nam của Nam Mỹ, trong khi các phân nhóm  Ib và F2 được tìm thấy ở các nước thuộc Châu Mỹ, trừ vùng phía Bắc và phía Nam Nam Mỹ.

Các kiểu gen B và C hay gặp ở vùng Đông Á và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam [10, 11]. Kiểu gene C của HBV có liên quan đến nguy cơ tăng lên của xơ gan và ung thư tế bào gan [14, 15]. Kiểu gen B có sự chuyển đổi huyết thanh (seroconversion) của HBeAg sớm hơn của kiểu gene C.

3. Các đột biến vùng Enh II/ BCP/PC và PreS:

3.1. Các đột biến có liên quan đến nguy cơ tăng lên của xơ gan:

Việc xác định các đột biến trên vùng Enh II/ BCP/PC và PreS có thể giúp đánh giá nguy cơ tăng lên của xơ gan. Yin J và cộng sự (2011) [13] thấy rằng, các đột biến ở các vị trí 1652, 1673, 1674, 1719, 1727, 1730, 1762, 1764, 1766, 1768,1773,1779 và 1896 ở genotype B và ở các vị trí 1673, 1726,1727, 1730, 1762, 1764, 1768,1773,1779 và 1896 ở genotype C ở bệnh nhân viêm gan B mạn có nguy cơ dẫn đến xơ gan. Còn ở những bệnh nhân đã bị xơ gan có HBeAg (-) tính, các đột biến ở các vị trí 1653, 1719, 1753, 1762 và 1846 ở genotype C có nguy cơ dẫn đến ung thư tế bào gan. Các tác giả này cũng cho rằng một số đột biến trên vùng Enh II/ BCP/PC và PreS ở các vị trí 1674, 1762, 1764 và 1896 ở genotype B và ở các vị trí 1674, 1753, 1762, 1764 và 1896 ở genotype C có nguy cơ dẫn thẳng đến ung thư biểu mô tế bào gan không qua giai đoạn xơ gan. Theo Yin và cộng sự 2011 [13], các đột biến vùng Enh II/ BCP/PC và PreS như A1673T, A1726C, A1727T, C1730G/A, C1766T, T1768A, C1773T và C1799G ở genotype C có liên quan một cách có ý nghĩa với xơ gan nhưng lại liên quan nghịch với nguy cơ ung thư biểu mô tế bào gan. Về cơ chế gây xơ gan, các đột biến này có thể liên quan với quá trình hàn gắn các tổn thương do sự viêm hoại tử (necroinflammation) hơn là với yếu tố gây ung thư (carcinogenesis) [13].

3.2. Các đột biến có liên quan đến nguy cơ tăng lên của ung thư biểu mô tế bào gan:

Việc xác định các đột biến trên vùng Enh II/ BCP/PC và PreS có thể giúp đánh giá nguy cơ tăng lên của ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Nguy cơ HCC phụ thuộc vào loại đột biến, sự kết hợp giữa các đột biến và số lượng đột biến.
 

3.2.1.  Các đột biến đơn: nhiều nghiên cứu trong những năm gần đây chỉ ra rằng các đột biến trên vùng Enh II/ BCP/PC và PreS như C1753T, T1674C/G, C1753T, T1753V, A1762T, G1764A riêng biệt hoặc kết hợp có liên quan đến nguy cơ tăng lên của HCC và rằng tần suất các đột biến này tăng dần trong quá trình nhiễm HBV từ trạng thái mang HBsAg không triệu chứng (asymptomatic hepatitis B surface antigen carrier: ASC) đến viêm gan mạn, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan [13]. Những nghiên cứu gần đây nhất còn cho thấy, 3 đột biến ở vùng Precore là A1846T, G1896A và G1899A cũng có liên quan đến nguy cơ tăng lên của ung thư biểu mô tế bào gan [4]. Các đột biến đơn này, riêng lẻ hoặc kết hợp, có thể là các chỉ dẫn hữu ích để đánh giá nguy cơ ung thư biểu mô tế bào gan ở những bệnh nhân nhiễm HBV mạn [13].

3.2.2. Các đột biến kép: một đột biến kép quan trọng nhất trong nguy cơ ung thư biểu mô tế bào gan đã được khẳng định là A1762T/G1764A. Trong khi độ nhạy của đột biến đơn T1753V đối với ung thư biểu mô tế bào gan là 33,7% thì độ nhạy của đột biến kép A1762T/G1764A là 80,0% và của đột biến kép A1762T/G1764A + T1753V lên đến 81,1% [13]. Về cơ chế gây ung thư tế bào gan, do sự che phủ giữa gene X và gene C trong cấu trúc DNA của bộ gene HBV, các đột biến T1753V, A1762T và G1764A gây nên sự thay đổi các acid amin (aa) ở các vị trí aa127 (I → T/N/S), aa130 (K→M) và aa131 (V→I) tương ứng ở protein X. Các đột biến trên gene X, đặc biệt là đột biến xóa C tận của protein X, trong sự tương tác giữa virus-vật chủ, có thể hoạt hóa các gene gây ung thư và các yếu tố gây ung thư. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng đột biến kép A1762T/G1764A thường xuất hiện khoảng 10 năm trước khi bệnh nhân biểu hiện ung thư biểu mô tế bào gan và là một các dấu ấn sinh học có giá trị (valuable biomarker) để chỉ dẫn nguy cơ cực kỳ cao của ung thư biểu mô tế bào gan [13].3.2.3. Số lượng các đột biến: theo Jang và cộng sự 2012 [4], ở bệnh nhân có từ 3 đến 6 đột biến liên quan đến nguy cơ ung thư biểu mô tế bào gan trở lên, giá trị chẩn đoán dương tính đối với nguy cơ ung thư biểu mô tế bào gan tăng từ 60,7% lên 94,3%.          Việc xác định các đột biến tại vùng Enh II/ BCP/PC và PreS có nguy cơ gây xơ gan và ung thư gan ở những bệnh nhân viêm gan mạn là rất hữu ích cho việc phân  loại bệnh nhân nhiễm HBV có nguy cơ phát triển xơ gan và HCC trong tương lai và chỉ ra việc cần thiết phải điều trị để giúp làm giảm nguy cơ xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan ở những bệnh nhân này đến mức thấp nhất.

4. Các đột biến kháng thuốc trên gene Polymerase

Hiện có ba nhóm thuốc kháng HBV (antiviral drugs) dạng uống đang được sử dụng phổ biến để điều trị viêm gan virus B mạn là: (1) nhóm L-Nucleoside gồm Lamivudine (LMV), Telbivudine (LdT), Emtricitabine (FTC) và Clevudine (L-FMAU); (2) nhóm Acyclic Phosphonate gồm Adefovir dipivoxil (ADV) và Tenofovir (ADV); (3) nhóm vòng Cyclopantane/ Pentene gồm Entecavir (ETV), Abacavir/ Cabovir (ABC). Các thuốc này có tác dụng ức chế enzyme reverse polymerase-enzyme xúc tác cho sự sao chép ngược từ mRNA thành DNA của HBV, do đó làm giảm sự nhân lên của HBV, từ đó làm giảm các biến chứng xơ gan, HCC và nguy cơ tử vong. Tuy nhiên, việc điều trị trong một thời gian dài với các thuốc này có thể làm xuất hiện các đột biến kháng thuốc  trên gen P, làm mất tác dụng của thuốc, dẫn đến thất bại điều trị và làm bệnh gan tiếp tục tiến triển [9].Cho đến nay, nhiều loại đột biến kháng thuốc của HBV đã được các nhà khoa học phát hiện và tất cả các đột biến này đều nằm trên vùng sao chép ngược của gene P. Gene P được chia thành 7 vùng (domains), được sắp xếp từ A đến G. Các đột biến kháng thuốc cơ bản trên gene P của HBV, dẫn đến sự thay đổi các bộ ba mật mã (codons), nghĩa là làm thay đổi các acid amin trong chuỗi polypeptide của enzyme reverse polymerase (rt). Sự thay đổi các acid amin trong các đột biến kháng thuốc thường gặp là: rtL80I/V (trên vùng A), rtI169T, rtV173L, rtL180M, rtA181T/V/S, rtT184A/S/G/C (trên vùng B), rtA194T, rtS202C /G/I , rtM204V/I (trên vùng C), rtN236T (trên vùng D), và rtM250V (trên vùng E). Các thay đổi acid amin này có thể riêng lẻ hoặc kết hợp, tạo nên mức độ kháng thuốc khác nhau của các chủng HBV kháng thuốc này.

Các đột biến kháng thuốc trong quá trình điều trị một thuốc duy nhất (monotherapy) [2, 3, 9] là: 

1. Các đột biến kháng Lamivudine gồm: rtL180M + rtM204V/I/S, rtM204I, rt80VI + rtM204I,  rtV173L + rtL180M + rtM204V, rtI169T + rtV173L + rtL180M + rtM204V/, rtA181T, rtT184S + rtL180M + rtM204V hoặc rtQ215S + rtL180M + rtM204V.2. Các đột biến kháng Adefovir gồm: rtN236T, rtA181V/T, rtV84M/ rtS85A/ rtL80V/I hoặc rtV214A/ rtQ215S.

3. Các đột biến kháng Entercavir: rtI169T + ntV173L + rtL180M + rtT184G + rtM204V, rtI169T + ntV173L + rtL180M + rtM204V + rtM250V hoặc có sự kết hợp các đột biến ở các codon 184, 202 và 250.  

4. Các đột biến kháng Telbivudine gồm: rtM204I hoặc có các đột biến liên quan đến kháng Lamivudine. 5. Các đột biến kháng Tenofovir gồm: rtL180M + rtA194T + rtM204V, rtV204A, rtQ215S hoặc rtA181V + rtM204I.

Các đột biến kháng đa thuốc khi điều trị phối hợp (combination therapy) từ hai thuốc [6,12] trở lên gồm các nhóm: 

Nhóm 1 : Các đột biến kháng đa thuốc Lamivudine + Adefovir gồm: rtM204I + rtL180M, rtM204V + rtL180M và rtM204I + rtM204V + rtL180M           Nhóm 2: Các đột biến kháng đa thuốc Lamivudine + Entecavir gồm: rtM204V + rtL189M + rtT184L, rtM204V + rtL189M + rtS202G và rtM204V + rtS202G.          Nhóm 3: Các đột biến kháng đa thuốc Lamivudine + Adefovir + Entecavir gồm: rtA181T + rtM204V + rtS202G và rtA181T + rtM204V + rtL180M + rtT184L.          Nhóm 4: Các đột biến kháng đa thuốc Lamivudine + Tenofovir gồm: rtV214A, rtQ215S, ±rtL180M + rtM204V và rtL180M + rtA194T + rtM204VNhóm 5: Các đột biến kháng đa thuốc Lamivudine + Adefovir + Tenofovir gồm: rtA181V + rtM204I.Việc xác định các đột biến kháng thuốc trên gene reverse transcriptase ở những bệnh nhân viêm gan mạn có biểu hiện kháng thuốc trong quá trình điều trị là việc làm rất cần thiết để người thầy thuốc quyết định thay thuốc mới hoặc kết hợp thuốc một cách hợp lý, giúp điều trị hiệu quả nhất.Một số marker phân tử có tiềm năng chẩn đoán, điều trị và tiên lượng viêm gan virus B mạn trong tương lai gồm: định lượng số lượng virus HBV DNA và cccDNA (covalently closed circular DNA) toàn phần trong gan (total intrahepatic) hoặc cccDNA trong huyết tương.

6. Kim SS, Cho SW, Kim SO, Hong SP, and Cheong JY. Multidrug-resistance hepatitis B virus resulting from sequential monotherapy with lamivudine, adefovir, and entecavir: clonal evolution during lamivudine plus adefovir therapy. J Med Vir 2013; 85: 55-64.

8. Liu S, Zhang H, Gu C, Yin J, He Y, Xie J and Cao G. Associations Between Hepatitis B Virus Mutations and the Risk of Hepatocellular Carcinoma: A Meta-Analysis. J Natl Cancer Inst 2009; 101: 1066-1082.

9. Qin B, Pei RJ, He TT, Huang ZH, Pan GS, Tu CY, Lu MJ and Chen XW. Polymerase mutations rtN238R, rtT240Y and rtN248H of hepatitis B virus decrease susceptibility to adefovir. Chinese Science Bulletin 2013 May; 58(15): 1760-1766.

10. Song LH, Duy DN, Binh VQ, Luty Ạ, Kremsner PG, Bock CT. Low frequency of mutations in the X gene, core promoter and precore region of hepatitis B virus infected Vietnamese. J Viral Hepat 2005 Mar; 12(2): 160-167.

11. Toan NL, Song LH, Kremsner PG, et al. Impact of the hepatitis B virus genotype and genotype mixtures on the course of liver disease in Vietnam. Hepatology 2006; 43:1375-1384.

12. Xu XH, Li GL, Qin Y, Li Q, He FQ, Li JY, Pan QR and Deng JY. Entecavir plus adefovir therapy for chronic hepatitis B patients after multiple treatment failures in real-life practice. Vir J 2013; 10: 162-166.  

13. Yin J, Xie J, Liu S, Zhang H, Han L, et al. Association between the various mutations in viral core promoter region to different stages of hepatitis B, ranging of asymptomatic carrier state to hepatocellular carcinoma. Am J Gastroenterol 2011 Jan; 106(1): 81- 92.

14. Yu MW, Yeh SH, Chen PJ, et al. Hepatitis B virus genotype and DNA level and hepatocellular carcinoma: a prospective study in men. J Natl Cancer Inst 2005; 97: 265-272.

15. Zhang Q, Cao G. Genotypes, mutations, and viral load of hepatitis B virus and the risk of hepatocellular carcinoma. Hepat Mon 2011; 11(2): 86-91.