1. Tổng quan về xét nghiệm PCR

1.1. Thế nào là kỹ thuật xét nghiệm PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là xét nghiệm sinh học phân tử dựa vào các chu kỳ nhiệt để tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm. Kết quả của xét nghiệm này có độ chính xác tương đối cao. 

Kỹ thuật PCR học theo những gì xảy ra trong các tế bào khi chúng sao chép DNA trước khi phân chia tế bào, chỉ khác là môi trường diễn ra của nó ở trong phòng thí nghiệm. Toàn bộ quá trình thực hiện kỹ thuật diễn ra trong máy đo nhiệt hoặc máy PCR, tùy từng bước của quy trình mà máy sẽ thay đổi nhiệt độ cho phù hợp.

Máy xét nghiệm PCR

Để thiết lập một PCR cần có 5 thành phần cơ bản:

- Mẫu DNA cần sao chép.

- Một đoạn DNA ngắn được thiết kế để liên kết với hai bên của phần DNA cần sao chép để bắt đầu phản ứng PCR.

- 4 loại nucleotide DNA, A, T, G, C là các vật liệu cơ sở để xây dựng lên các DNA mới.

- Enzyme DNA polymerase có khả năng chịu nhiệt.

- Các loại muối có thể tạo ra môi trường thích hợp để enzyme hoạt động.

1.2. Quy trình thực hiện kỹ thuật xét nghiệm PCR

Xét nghiệm PCR thường gồm một chuỗi 20 - 40 lần biến đổi nhiệt độ được lặp đi lặp lại trong đó mỗi chu kỳ gồm khoảng 2 - 3 giai đoạn nhiệt độ riêng. Mỗi chu kỳ thường sẽ bắt đầu bằng giai đoạn nhiệt độ cao (>90°C) sau đó dừng lại ở nhiệt độ thấp để lưu trữ sản phẩm PCR trong một thời ngắn hoặc khi sản phẩm cuối cùng được tổng hợp.

Quy trình này sẽ diễn ra qua các bước sau đây:

- Bước 1: Khởi đầu

Đây là giai đoạn chỉ cần thiết đối với các enzym ADN polymerase cần kích hoạt bằng nhiệt độ. Nhiệt độ phù hợp ở giai đoạn này là 94 - 96 độ C, tiến hành khoảng 1 - 9 phút.

- Bước 2: Biến tính

Nếu không có giai đoạn trên thì đây được xem là bước đầu tiên của chu kỳ. Nhiệt độ phù hợp là 94 - 98 độ C, thực hiện trong 20 - 30 giây. Trong quá trình này, bằng cách phá vỡ liên kết hidro giữa các bazơ mà ADN sẽ được biến tính thành phân tử ADN sợi đơn.

Mẫu bệnh phẩm được dùng để thực hiện xét nghiệm PCR

- Bước 3: Gắn mồi

Nhiệt độ ở giai đoạn này chỉ khoảng 50 - 65 độ C. Đây là khoảng nhiệt độ vừa phù hợp để cho phép mồi bắt cặp với sợi ADN vừa đảm bảo cho quá trình bắt cặp đặc hiệu. Nhiệt độ để quá thấp thì mồi gắn không đặc hiệu mà quá cao thì có thể mồi lại không gắn. Toàn bộ quá trình diễn ra trong 20 - 40 giây.

- Bước 4: Kéo dài

Tùy thuộc các ADN polymerase được đưa vào sử dụng mà setup nhiệt độ. Ở bước này, bằng cách thêm dNTP, ADN polymerase tổng hợp sợi ADN mới sẽ bổ sung cùng với ADN khuôn. Thời gian tiến hành quá trình phụ thuộc vào ADN polymerase cũng như độ dài của đoạn DNA cần khuếch đại. 

- Bước 5: Kết thúc kéo dài

Đôi khi bước này sẽ được thực hiện ở nhiệt độ 70 - 74 độ C với thời gian 5 - 15 phút sau chu kỳ PCR cuối cùng. Mục đích đạt được là tổng hợp được tất cả ADN sợi đơn còn lại.

- Bước 6: Bảo quản

Nhiệt độ phù hợp vào khoảng 4 - 15 độ C để bảo quản ngắn hạn sản phẩm có được từ phản ứng.

2. Một số loại xét nghiệm PCR thường dùng để chẩn đoán bệnh lý nhiễm trùng

2.1. Xét nghiệm PCR Dengue

Đây là loại xét nghiệm nhằm chẩn đoán sớm 4 chủng của bệnh sốt xuất huyết. Xét nghiệm PCR Dengue có khả năng phát hiện virus Dengue gây sốt xuất huyết trong máu từ ngày đầu tiên đến ngày thứ 5 kể từ khi người bệnh có dấu hiệu sốt. Sở dĩ xét nghiệm trở nên hữu ích bởi vì kháng thể IgM và IgG trong máu xuất hiện chậm. Nếu kết quả xét nghiệm âm tính trong 5 ngày đầu thì xem như chưa xác định và người bệnh cần được lấy mẫu máu thứ 2 cách sau đó 5 ngày để định lượng Dengue IgM và IgG nhằm xác định chính xác có nhiễm virus Dengue hay không.

2.2. Xét nghiệm PCR lao

Nhiễm trùng trong bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây nên. Xét nghiệm PCR lao có khả năng xác định vi khuẩn lao trực tiếp trong bệnh phẩm chỉ trong vài giờ. Thậm chí ngay cả khi  ở nồng độ rất thấp (khoảng 1 - 3 vi khuẩn/mL bệnh phẩm) vẫn có thể tìm thấy vi khuẩn lao. Xét nghiệm có ý nghĩa đặc biệt trong việc tìm vi khuẩn lao ở nơi mà lượng vi khuẩn thường rất thấp như các mẫu bệnh phẩm: dịch màng tim, dịch ổ khớp, dịch não tủy,… 

Xét nghiệm PCR lao giúp chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh lao

2.3. Xét nghiệm PCR HLA-B27

HLA là một hệ kháng nguyên có chủ yếu trên bạch cầu và tiểu cầu. HLA-B27 là kháng nguyên có mối liên quan chặt chẽ với bệnh viêm cột sống dính khớp. Vì thế xét nghiệm PCR HLA-B27 cho phép chẩn đoán sớm bệnh lý này. Mẫu bệnh phẩm được thực hiện xét nghiệm là 2ml máu toàn phần chống đông EDTA, bảo quản ở nhiệt độ phòng trong vòng 24h hoặc 2 - 8 độ C, trong 72 giờ. Bằng kỹ thuật SHPT, xét nghiệm giúp phát hiện gen quy định kháng nguyên HLA-B27 trên nhiễm sắc thể số 6 của người có nguy cơ bị viêm cột sống dính khớp.

2.4. Xét nghiệm QF-PCR 

QF-PCR là một loại xét nghiệm PCR huỳnh quang định lượng dùng để sàng lọc trước sinh nhằm kiểm tra liều gen. Xét nghiệm giúp tìm rối loạn nhiễm sắc thể cho trường hợp thai có nguy cơ cao với hội chứng Down, Edwards, Turner,... Mẫu bệnh phẩm được sử dụng có thể là: dây rốn, máu dây rốn, dịch ối, máu, gai nhau,...

Dù là loại xét nghiệm PCR với mục đích gì thì đây cũng là kỹ thuật cần có sự đầu tư nghiêm túc từ trang thiết bị, môi trường phòng thí nghiệm cho đến đội ngũ nhân lực thực hiện giàu kinh nghiệm. Tất cả các thiết bị y tế phục vụ cho xét nghiệm này đều phải nhập khẩu từ nước ngoài với mức chi phí khá đắt. 

Trong số các thiết bị ấy có thể kể đến một số thiết bị như: máy đọc kết quả điện di, máy PCR Mastercycler X50s, máy ủ nhiệt Thermomixer F1.5, tủ thao tác PCR UVP, tủ âm sâu Eppendorf và tủ lạnh, máy vortex,... Phòng tiến hành xét nghiệm PCR đạt tiêu chuẩn phải gồm 6 phòng riêng biệt. Để tránh nhiễm chéo từ sản phẩm sau khuếch đại thì phòng cần thiết kế hoạt động theo một chiều. 

Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC là một trong số ít cơ sở y tế tư nhân ở nước ta có được sự đầu tư ngay từ đầu những yếu tố được nói đến trên đây. Phòng xét nghiệm PCR của bệnh viện vì thế đã đáp ứng được mọi tiêu chuẩn nghiêm ngặt nhất của Bộ y tế, giúp hàng nghìn bệnh nhân sớm có được kết quả xét nghiệm chính xác trong thời gian ngắn, dành thời gian để tập trung điều trị.

Nếu có nhu cầu tìm hiểu về trung tâm xét nghiệm hoặc thực hiện xét nghiệm PCR tại Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC, đừng ngần ngại liên hệ tổng đài 1900565656, chuyên viên y tế của chúng tôi luôn sẵn lòng cung cấp những thông tin cần thiết, chính xác nhất để bạn yên tâm thực hiện xét nghiệm này.